图1:DNA, RNA, Protein的表观遗传修饰
图2:RNA甲基化修饰示意图
j6国际建立了子宫内膜基质细胞蜕膜化的模型:在雌、孕激素处理的基础上再加入cAMP三者联合诱导产生蜕膜化。采用三者联合诱导的原因是雌激素可使子宫内膜增生,cAMP可通过调节转录因子的活性来增加子宫内膜基质细胞对孕酮的敏感性;同时通过检测蜕膜化的标志分子如PRL、IGFBP-1、ACP(酸性磷酸酶)、hsp27和层粘连蛋白等来判断诱导蜕膜是否成功。子宫内膜基质细胞产生蜕膜化后,经HE染色显示,细胞核呈现多核化,胞体大而圆,为蜕膜化成功一个标志,如下图所示。
1)预制病毒
基因名 |
种属 |
类型 |
转录本 |
内部编号 |
ALKBH5 |
人 |
过表达慢病毒 |
NM_017758 |
CL203 |
ALKBH5 |
大鼠 |
干扰慢病毒 |
NM_001191643 |
CL1931 |
METTL3 |
人 |
过表达慢病毒 |
NM_019852 |
CL1638 |
METTL3 |
人 |
干扰慢病毒 |
NM_019852 |
CL1240 |
METTL3 |
小鼠 |
过表达慢病毒 |
NM_019721 |
CL1032-1 |
METTL14 |
人 |
过表达慢病毒 |
NM_020961 |
CL1961 |
METTL14 |
人 |
干扰慢病毒 |
NM_020961 |
CL1963 |
METTL14 |
小鼠 |
过表达慢病毒 |
NM_201638 |
CL1032-2 |
FTO |
小鼠 |
过表达慢病毒 |
NM_011936 |
CL1032-3 |
2)检测整体的m6A甲基化水平:采用类似于ELISA竞争免疫的方法,样本与m6A抗体孵育;然后转移到包被有m6A多核苷酸的孔上。样本RNA上的m6A可竞争性抑制m6A抗体与涂抹在孔上m6A的结合。因此,微孔板读取仪测的信号与样本中m6A的整体含量成反比。并且样本中m6A的量可以通过预先设定的m6A标准品来实现定量检测。
3)检测特定基因的m6A甲基化水平(MeRIP-qPCR):将RNA免疫共沉淀(RIP)与荧光定量PCR相结合的技术,通过特异性抗体富集total RNA中发生m6A甲基化修饰的RNA,借助特异性引物实现对m6A修饰的RNA进行定量的目的,可以应用于经MeRIP-seq发现的m6A修饰的基因(或已知的某个靶基因)在组间样本中m6A修饰水平的差异。
4)m6A RNA甲基化测序(MeRIP-Seq):可进行m6A RNA甲基化谱研究,快速筛选m6A RNA甲基化靶基因;将甲基化RNA免疫共沉淀和RNA测序技术组合起来,可一次性检测样品中所有RNA分子上的m6A甲基化修饰状况,并计算出不同样本中RNA差异m6A甲基化程度。
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